illumina 双端测序

illumina 双端测序（pair end）

illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis, SBS ）

Flowcell（流动池）是有着2个或8个lane（泳道）的玻璃板，每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别 互补配对或一致 的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。一个lane包含两列，每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。

B站视频链接，讲的很详细： 陈巍学基因视频1：Illumina测序化学原理_哔哩哔哩_bilibili

1. 利用转座子（transposome）对双链DNA进行剪切以及接头（adapter）的连接

2. 接头连接成功后，利用低循环扩增技术在接头处进行修饰，分别在两端添加sequencing primer binding site1 / sequencing primer binding site2（即测序引物结合位点）、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列

下图是维基百科的示意图，详细一些。

注意：

关于index，也叫barcodes，因为一个lane可以同时测多个样品，为了避免混淆样品的read products，每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序得到的reads都是具有index标记的，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据。而这里的 index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads 。

1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列，分别 与P5互补（即P5’），与P7一致（即P7） 。

2. 待测sequence通过P5与folwcell上的P5’序列杂交互补，以待测sequence为模板进行互补链（即reverse strand）的延伸，互补链的两端为P5’和P7’。

3. 接下来模板链被切断并洗下

Reverse strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，这就是我们所熟知的 桥式PCR

接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸，解链，杂交，延伸，解链...如此重复35个循环

4. 桥式PCR完成后，使用NAOH将双链解链，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作用，选择性地将P5’与链的连接切断， 留下与Flowcell上P7连接的链 ，也就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断，防止不必要的DNA延伸

1. 测序引物（sequencing primer）结合到靠近P5的测序引物结合位点1（sequencing primer binding site 1）上，在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。这里的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不一样；它的3’末端连了一个叠氮基，这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连

因此在聚合酶的作用下，与Forward strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上，而由于叠氮基的存在，后面的dNTP无法继续连接。这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进行扫描，扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应，因此一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后，加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进行下一个循环（碱基的连接、检测与切除）。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，也就是Forward read 序列。

2. Index测序：所有循环结束后，read products 被洗掉，index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进行index1的合成及检测

3. Index1测序完成后，洗脱测序产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列

4.Index2测序：Forward strand顶端的P5序列与Flowcell上的P5’杂交配对，进行index2测序。测序完成后洗脱产物

1. 洗脱index2测序产物后，以Flowcell上的P5’为引物，Forward strand为模板进行桥式扩增，得到双链

2. NAOH使双链变性为单链，并洗去已经测序完成的Forward strand

3. 类似的，readprimer2结合到靠近P7’的read primer binding site 2开始对Reverse strand的测序。测序完成后即可得到Reverse read序列。

前面介绍的都是paired-end的测序，而single-end测序方式是只将index，sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列

什么是基因二代测序？

目前我们主要分析的数据还是二代测序的数据，也就是大家经常挂在嘴边的 NGS ，而这其中最大的赢家应该算是 illumina 测序公司了，其经典的边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）巧妙地利用带不同荧光的dNTP来让碱基组成可视化，本身还是很有意思的。但随之而来的就有一些问题，比如以RNA-seq为例， 如果你是一个经典的从表达矩阵开始的数据分析选手，那其实建库细节对你来说好像也没那么重要；而如果你是一个从原始fastq下机数据（甚至建库实验）开始的数据分析选手，此时建库的细节就可能显得尤为重要，需要你做到知根知底。 或许你经常遇到一些名词，其中有一些可能让你感到迷惑：

现在我们就以illumina经典的 TruSeq Stranded mRNA 建库测序为例来走一遍整个illumina测序的流程，为什么会选择这个建库策略呢？ 首先，RNA-seq是目前我们触手可及、应用最广的基因表达量检测技术；其次，相较之于链非特异性测序，链特异性测序对大多数人来说更复杂，更难以理解。 关于链特异性测序我之前已经有一个长篇大论谈到了这个问题： 一文阐述链特异性测序——stranded? reverse-stranded? un-stranded? ，阅读量还不错，反馈也还可以，有兴趣的可以去看看，在这里就只以 TruSeq Stranded mRNA 为例了。

老规矩，我还是以图辅以文字的方式来先整体介绍一下 TruSeq Stranded mRNA ：

对着流程看，提前说一下， 红色始终代表sense strand的信息，天蓝色代表antisense strand的信息 ：

注意了，我们现在回到这个结构，开始走上机测序的流程：

做过fastq文件比对的人都知道，这个过程中非常重要的，大家挂在嘴边的就是 去接头 ，第三个名词出来了： adapter 。那么到底什么是接头？ fastqc 这样的软件又是怎样检测到的？ cutadapt 、 fastp 、 trimmomatic 、 trim_galore 这些软件又是怎么去接头的？似乎这些都是灰色地带，下面是我的理解：

首先还是看文库结构：

这实际上很好理解，我们没有人去adapter是从fastq文件中每条read的开头去的。那么什么是adapter呢？你可以简单理解为，在一个文库中，非生物学序列的其余序列都属于adapter，包括 P5、P7、测序引物结合位点 。那么fastqc是怎么检测adapter的呢？你去看看fastqc的GitHub，会发现它有这样的几个序列：

你可能会觉得很神奇，其实fastqc判断你的序列有没有adapter就是在和这几个序列做简单的匹配罢了。接踵而来的问题就是：

首先给答案：

听起来很离谱，画个图就清楚了：

果然，不能说完全相同，只能说一模一样，也就是说，现在市场上所有的Tn5转座酶都必须将这段序列连接到DNA的两端，这样才能让我们检测到adapter。

你可能还是不信，好吧，那再来一个其它的例子吧：

这不能说完全相同，只能说一模一样吧……总该信了？

结束了上面的测试，你或许会发现一个问题： 那按这么说，是不是read1和read2的测序引物的3'端总是会有部分是一样的啊？一样的部分就是作为判断adapter是否存在的那条序列？ 你自己看看上面的那个图，不就知道了， 事实上就是这样。

最后，为了让你更信，我还把trim_galore的adapter序列也粘贴在这里，这不和fastqc的一模一样？原来纷繁复杂的illumina测序竟然这么统一！

第二代测序为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。

经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。

第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。

1）测序文库的构建（Library Construction）

首先准备基因组（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。

2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification）

Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。

3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification）

添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）

在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。

5）数据分析（Data Analyzing）

这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。

参考资料：

百科狗 baikegou.com